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新型冠状病毒核酸检测方案

责任编辑:东岱科学器材来源:东岱科学器材日期:2020-02-25 16:02浏览次数:

    2019年底在湖北省武汉市爆发的新型冠状病毒被列为乙类传染病,具有高传染性,按照国家规定,需采用甲类传染病的预防,控制措施。

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    那么,怎样在“金标准”核酸检测方法下做好病毒检测工作呢?

    根据目前研究已知,该病毒基因组大小约为30kb,具有ORF1a/b非结构蛋白编码区;结构蛋白E(Envelop),M(膜蛋白),N(核衣壳),S(表面蛋白)编码区;辅助蛋白orf 3, 6, 7a, 7b, 8和9b编码区。因此,检测的探针引物设计必须保证准确性和特异性。罗氏的TIB检测试剂盒在设计时,参照已发表的病毒基因组序列设计了三组探针引物,分别是E基因,RdRP基因(位于ORF1ab)和N基因。其中E基因保守性强,用于初步筛查;RdRP基因特异性强,用于COVID-19(WHO最新命名)的检测;N基因特异性较强,用于复检防止漏检,也可检测类SARS病毒。整体设计比较严谨合理,符合当下的检测需要。

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    当拿到检测试剂盒后,又要怎样开展实验呢?下面是一个简易的流程图:

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    首先,样本采集。样本类型主要分为呼吸道样本,血液样本和粪便样本。

    呼吸道样本:

    1. 上呼吸道标本:包括咽拭子、鼻拭子,鼻咽或口咽抽吸物或洗液等。

    2. 下呼吸道标本:支气管肺泡灌洗液、呼吸道抽取物、痰液和肺组织活检标本。

注意: 拭子标本只能用带有铝杆或塑料杆的人造合成拭子头(例如聚酯纤维或涤纶)收集。不允许使用木杆的海藻酸钙或棉质的拭子头。

    血液样本:

    尽量采集发病后7天的急性期抗凝血。采集量5 ml, 以空腹为佳,建议使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管血液。

    粪便样本:

    出现腹泻症状的患者需采集粪便标本(肛门拭子)。

   (同时,要注意的是,标本采集后在4℃最多保存72小时;如果不能及时检测,则将标本在-70 ℃或以下保存;提取的核酸应在-70℃或以下保存。)

    再次,是样本前处理。

    根据国家卫健委的建议,要经过56℃,30分钟的灭活处理;或者按照WHO的方案,可加入含有(硫氰酸胍,异硫氰酸胍)胍盐的裂解液,高温孵育, 60℃ 60 min。为了最大程度上保证实验人员的安全,推荐使用罗氏提供的MagNA Pure 96 External lysis buffer(含胍盐)进行外部裂解与灭活。

    然后,进入到核酸提取阶段,分为手工提取法和全自动核酸提取。

    核酸提取是整个实验流程中比较关键的步骤,若提取效果不佳,会影响到后续的实验和结果分析。

    手工提取可以采用市售各品牌手提试剂盒,也可以选择罗氏的High Pure Viral RNA Isolation Kit手提试剂盒,该试剂盒采用的是柱式提取法,效果比较稳定。

    全自动核酸提取会越来越多应用在临检部门,特别是针对这种突发情况,可以做到在短时间大批量(1个小时96个样品)的开展核酸提取工作。我们推荐的病毒核酸自动提取方案如下:

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(其中设备下的提取Protocol全部经过验证,可以满足此次疫情的核酸提取需要。)

    接下来,得到满足检测要求的核酸后,就可以开展定量PCR实验检测样本了。根据不同实验室的要求,对样本的布板可以采取以下形式:

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注意:1. NTC至少1个;PC一个;阳性质控品开盖前离心,防止污染。

      2. 室间质评:NC三个随机放置;LPC 一个

(北京市开展新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测质量控制的工作方案(试行第一版)

 

    在荧光定量PCR仪上的设置按如下程序进行:

    反转录,55℃,5min——预变性,95℃,5min——扩增,95℃,5s;60℃,15s,采集信号;72℃,15s(45Cycler)——冷却,40℃,30s。

可适用于罗氏品牌下的LightCycler 480 I,LightCycler 480 II,LightCycler 96和Cobas Z480等机型上。

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   结果的判读,遵循综合判定法,即:

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   最后为实验后的消毒处理,所有操作台面用75%酒精或其他消毒液喷洒消毒,所有个人防护用品经高压灭菌后处理,放入三层医疗废物袋中集中处理。(可参考北京协和医院发布的个人防护方案和检测后处理方案。)

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