2020年必备神器，你知道吗？

单细胞测序( Single-Cell Sequencing) 无疑是2019生物领域最火的热点之一，应用这一技术发表的文章越来越多，截止目前，国内科学家已经发表了107篇高分文章，涉及到的物种有人类，小鼠，果蝇，斑马鱼，鹿，扇贝，拟南芥，拟兰，棉花，罂粟等等；关于单细胞研究的组织类型有胚胎，脑，视网膜，心脏，胰腺，前列腺，胃，脂肪，骨髓等等......在这百余篇高分文章中，有90篇是在2019年发表的，期待2020年的单细胞文章大爆发！

今天我们就详细的讲解一下单细胞测序神器。

研究背景

随着生物学的不断发展，细胞群体的研究已不再能满足科研需求；单细胞测序解决了用组织样本测序或样本少时无法解决的异质性难题，为科学家解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系提供了新方向，单细胞测序已逐渐成为科研热点。

单细胞测序即从单个细胞水平上对基因组或转录组进行高通量测序分析的一项新技术。与传统高通量测序相比，单细胞测序不仅能够分析相同表型细胞的异质性，还能获取难以培养微生物的遗传信息以及珍贵的临床样本的信息，具有广阔的应用前景。

把基因测序应用到单个细胞层面，对于识别细胞的类型、功能，特定细胞健康或状态的变化、变异至关重要，已广泛应用于神经生物学，种系传播，器官生长，癌症生物学等多个领域。 

10x Chromium Controller

单细胞水平的高通量基因表达谱分析，对复杂细胞群体深入分析，表征单个细胞的表达谱。可同时检测CRISPR干扰、细胞表面蛋白，避免单个细胞的异质性生物学信息被大量细胞的均质化掩盖。

10x Genomics 3'单细胞表达谱分析，通过微流体芯片将单个细胞分配到单个油包水液滴中，进行反应。同时可以获得 100-10000个细胞的表达信息，从而实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，是肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测以及胚胎发育研究的黄金方法。

基于Feature Barcoding技术，可检测细胞表面蛋白，能同时评估mRNA和蛋白表达谱的差异，获得更详细的细胞表型特征。

技术原理

10x Genomics仪器小巧，但功能强大，具有通量高、灵活性强、流程简单、技术性能高、单个细胞制备成本低等优势，其技术核心是油滴包裹的凝胶珠（GEM），该系统有数百万种barcoded bead。

技术优势

通量高，一次可以同时测8个样本；

每个样本可测10000个细胞；周期短，

18分钟内完成上万个细胞封装；

一天之内完成细胞悬液制备、单细胞捕获、cDNA扩增以及建库；

捕获效率高，单细胞捕获效率高达65%；

应用范围广，动物细胞、植物细胞均可以进行单细胞测序。

技术流程    

GEM形成后，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列，随后mRN逆转录产生带有Barcode和UMI标记的cDNA。 

油滴破碎，cDNA为模板进行PCR扩增，然后进行酶切、末端修复、加测序接头P5及测序引物R2等传统二代测序的建库过程。 

测序后，得到每个细胞的转录组表达谱。

数据分析

10x提供免费的专业的数据分析软件：    

Cell Ranger分析流程，是10x Genomics针对单细胞转录组测序开发的完整分析流程，结合转录比对数据和标示细胞的barcode信息，该流程能进行细胞聚类、差异基因筛选、差异基因功能分析。

Loupe Cell Browser 可视化分析

样本准备 

细胞类型：生殖细胞、胚胎细胞、神经细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞、其他原代细胞等动物细胞；植物细胞（提取原生质体)。 

细胞状态：细胞直径<40μm（≥40μm时，需抽取细胞核）；细胞活性>90%；细胞浓度5×10⁵~1.2×10⁶/ml；双细胞率低于5%；在制备细胞悬液时，缓冲液不含Ca²⁺和Mg²⁺。 

应用领域

肿瘤（微环境、耐药、免疫等）；细胞异质性研究；新型细胞发现；发育及分化；免疫反应；构建细胞图谱；定点编辑基因的细胞水平研究……

应用方向

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