新型冠状病毒核酸检测方案

    2019年底在湖北省武汉市爆发的新型冠状病毒被列为乙类传染病，具有高传染性，按照国家规定，需采用甲类传染病的预防，控制措施。

    那么，怎样在“金标准”核酸检测方法下做好病毒检测工作呢？

    根据目前研究已知，该病毒基因组大小约为30kb，具有ORF1a/b非结构蛋白编码区；结构蛋白E（Envelop），M（膜蛋白），N（核衣壳），S（表面蛋白）编码区；辅助蛋白orf 3, 6, 7a, 7b, 8和9b编码区。因此，检测的探针引物设计必须保证准确性和特异性。罗氏的TIB检测试剂盒在设计时，参照已发表的病毒基因组序列设计了三组探针引物，分别是E基因，RdRP基因（位于ORF1ab）和N基因。其中E基因保守性强，用于初步筛查；RdRP基因特异性强，用于COVID-19（WHO最新命名）的检测；N基因特异性较强，用于复检防止漏检，也可检测类SARS病毒。整体设计比较严谨合理，符合当下的检测需要。

    当拿到检测试剂盒后，又要怎样开展实验呢？下面是一个简易的流程图：

    首先，样本采集。样本类型主要分为呼吸道样本，血液样本和粪便样本。

    呼吸道样本：

    1. 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子，鼻咽或口咽抽吸物或洗液等。

    2. 下呼吸道标本：支气管肺泡灌洗液、呼吸道抽取物、痰液和肺组织活检标本。

注意： 拭子标本只能用带有铝杆或塑料杆的人造合成拭子头（例如聚酯纤维或涤纶）收集。不允许使用木杆的海藻酸钙或棉质的拭子头。

    血液样本：

    尽量采集发病后7天的急性期抗凝血。采集量5 ml， 以空腹为佳，建议使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管血液。

    粪便样本：

    出现腹泻症状的患者需采集粪便标本（肛门拭子）。

   （同时，要注意的是，标本采集后在4℃最多保存72小时；如果不能及时检测，则将标本在-70 ℃或以下保存；提取的核酸应在-70℃或以下保存。）

    再次，是样本前处理。

    根据国家卫健委的建议，要经过56℃，30分钟的灭活处理；或者按照WHO的方案，可加入含有（硫氰酸胍，异硫氰酸胍）胍盐的裂解液，高温孵育， 60℃ 60 min。为了最大程度上保证实验人员的安全，推荐使用罗氏提供的MagNA Pure 96 External lysis buffer（含胍盐）进行外部裂解与灭活。

    然后，进入到核酸提取阶段，分为手工提取法和全自动核酸提取。

    核酸提取是整个实验流程中比较关键的步骤，若提取效果不佳，会影响到后续的实验和结果分析。

    手工提取可以采用市售各品牌手提试剂盒，也可以选择罗氏的High Pure Viral RNA Isolation Kit手提试剂盒，该试剂盒采用的是柱式提取法，效果比较稳定。

    全自动核酸提取会越来越多应用在临检部门，特别是针对这种突发情况，可以做到在短时间大批量（1个小时96个样品）的开展核酸提取工作。我们推荐的病毒核酸自动提取方案如下：

（其中设备下的提取Protocol全部经过验证，可以满足此次疫情的核酸提取需要。）

    接下来，得到满足检测要求的核酸后，就可以开展定量PCR实验检测样本了。根据不同实验室的要求，对样本的布板可以采取以下形式：

注意：1. NTC至少1个；PC一个；阳性质控品开盖前离心，防止污染。

      2. 室间质评：NC三个随机放置；LPC 一个

（北京市开展新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测质量控制的工作方案（试行第一版）

    在荧光定量PCR仪上的设置按如下程序进行：

    反转录，55℃，5min——预变性，95℃，5min——扩增，95℃，5s；60℃，15s，采集信号；72℃，15s（45Cycler）——冷却，40℃，30s。

可适用于罗氏品牌下的LightCycler 480 I，LightCycler 480 II，LightCycler 96和Cobas Z480等机型上。

   结果的判读，遵循综合判定法，即：

   最后为实验后的消毒处理，所有操作台面用75%酒精或其他消毒液喷洒消毒，所有个人防护用品经高压灭菌后处理，放入三层医疗废物袋中集中处理。（可参考北京协和医院发布的个人防护方案和检测后处理方案。）